【摘要】 目的:探讨山莨菪碱(6542)对家兔创伤性急性肺损伤(ALI) 治疗 作用的分子生物学机制. 方法 :采用创伤性急性肺损伤模型,将家兔随机分为对照组(G),肺损伤组(IG)和治疗组(EG),每组24只. 各组动物分别于肺损伤模型建立后1, 2, 3, 4 h各放血处死6只,留取支气管肺泡灌洗液(BALF),分离肺泡巨噬细胞(PA),用凝胶电泳迁移率改变 分析 法(ESA)和RTPR法检测PA中NFκB的活性变化及TNFα RNA的表达水平,用ELISA法检测BALF上清中TNFα和IL8的含量. 结果:IG NFκB活性、TNFα RNA表达及TNFα, IL8含量于模型建立后1~4 h内均明显高于G(P<0.01);EG经山莨菪碱治疗后上述指标与IG相比均有明显下降(P<0.01, P<0.05). 结论:山莨菪碱对ALI有治疗作用,此作用与其对NFκB活性及TNFα RNA, TNFα, IL8表达抑制有关.
【关键词】 山莨菪碱;创伤;急性肺损伤;核因子κB;细胞因子
0引言
TNFα等细胞因子的释放及其介导的炎症反应在急性肺损伤(aute lung injury, ALI)的发生、 发展 中起重要作用[1]. NFκB是一种基因转录调节蛋白,通过调控TNFα和白细胞介素等细胞因子的转录,在炎症、免疫、急性期反应中发挥重要作用[2]. 山莨菪碱是一种植物药,在休克、全身炎症反应综合征的治疗中,显示出一定的保护作用[3]. 此类药物在AIL的防治中也有一定的价值,但作用机制尚不明了[4]. 我们采用分子生物学技术对山莨菪碱治疗创伤性ALI时NFκB活化、TNFα RNA表达及BALF中TNFα, IL8的释放进行 研究 ,探索其治疗创伤性ALI的可能机制.
1材料和方法
1.1材料健康成年家兔,雌雄不拘,体质量2.0~2.5 kg,由本校动物实验中心提供. Lipplysaharide(111:B4,LPS,Siga);NEPERT试剂盒(Piere);Gel Shift Assay 试剂盒(Prega);γ32P ATP(北京亚辉生物医学工程公司);Trizl Reagent(Gib);RNA PR试剂盒(大连Takara);ELISA试剂盒购自本校基础部免疫学教研室.
1.2方法健康成年家兔72只,随机分为正常对照(ntrl grup,G)、创伤性急性肺损伤(Injury grup,IG)和山莨菪碱治疗(Experiental grup,EG)3组,每组24只. IG, EG动物LPS注射联合撞击,建立创伤性急性肺损伤模型,G不做胸壁撞击,静注等量生理盐水代替内毒素. EG动物于模型建立后立即予以山莨菪碱2 g/kg iv,随后以1 g (kg/h)维持,G和IG分别予以等量生理盐水,剂量与方法同EG. 各组分别于模型建立后1, 2, 3, 4 h由颈动脉插管放血处死6只动物. 立即行气管插管,用生理盐水分两次行支气管肺泡灌洗(brnhalvelar lavage fluid,BALF),5 L/次,共10 L,回收率70%左右. 将BALF 1000 r/in离心10 in,沉淀用PBS液洗涤后用RPI 1640培养液悬浮,置于25 L培养瓶中,37℃,50 L/L 2孵箱中培养1 h,收集贴壁细胞,计数、瑞氏染色证实为巨噬细胞,纯度>95%,台盼蓝排斥试验鉴定细胞活力>90%.
1.2.1NFκB活性的检测用NEPERT Nulear and ytplasi Extratin Reagents提取PA核蛋白,-70℃保存,Bradfrd法测定蛋白浓度;用γ32P ATP标记NFκB寡核苷酸探针(由Gel Shift Assay 试剂盒提供)(5′AGT TGA GGG GA TTT AGG 3′,3′TA AT TG AAA GGG T G5′),采用乙醇纯化法纯化,并用凝胶电泳迁移率改变分析法(ESA)测定NFκB的活性,用凝胶图像分析系统对放射自显影胶片进行扫描,以各样品与标准品电泳滞后带的光密度比值来表示NFκB的活性,同时进行特异性及非特异性竞争试验.
1.2.2TNFα RNA表达用Trizl Reagent试剂盒提取PA总RNA,采用RTPR法检测各时间点PA中TNFα RNA水平,参照 文献 方法设计特异引物:TNFα1:5′GT A GGA AA A GT3′,TNFα2: 5′T AA AGT AGA T G 3′,扩增产物332 bp,选用βatin作内参对照,与TNFα DNA一同扩增. 扩增产物行20 g/L琼脂糖凝胶电泳,凝胶图像分析系统分析,以TNFα和βatin扩增产物(177 bp)的光密度比值来反应各组样品TNFα RNA的表达水平.
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