作者：王宝平，马向东，马佳佳，陈必良
【摘要】目的： 研究 甲氧滴滴涕（X）对颗粒细胞凋亡的 影响 ，探讨X对雌性小鼠性腺毒性的作用机制. 方法 ：以孕马血清（PSG）处理的雌性昆明小鼠为模型,制备颗粒细胞悬液,以不同浓度的X（1.25,2.50，5.00和10.00μg/L）对其作用24，48h后, 应用 TUNEL法及流式细胞术,检测X对离体培养颗粒细胞凋亡的影响.结果：体外培养的颗粒细胞存在自发性凋亡，对照组和X不同浓度实验组的颗粒细胞都有不同程度的体积变小、细胞浓缩、变圆、离壁等类似凋亡的特征.X1.25μg/L浓度组凋亡的颗粒细胞最少,其余3个实验组随X浓度的升高,凋亡细胞也逐渐增多,X10.00μg/L浓度组的颗粒细胞凋亡数量显著高于对照组和其他各组(P<0.05).采用3′末端原位标记法在细胞中检测到棕色深染的凋亡颗粒细胞；流式细胞术 分析 结果显示处于早期凋亡的细胞所占百分率明显升高(最高达53.5%).结论：环境污染物高浓度X可抑制除血清后体外培养的颗粒细胞生长,导致颗粒细胞凋亡,它的作用是双向的并具有剂量依赖性.
【关键词】甲氧滴滴涕;卵泡颗粒细胞;细胞凋亡;小鼠
【Abstrat】AI:Tinvestigatetherelatinshipbeteenfealegnadtxiityfethxyhlr(X)nuseandtheapptsisfgranulsaells.ETHDS:Pregnantaresserugnadtrphin(PSG)treatedfealeKuningieereusedasdelsandgranulsaellsuspensinsereprepared.X(1.25,2.50，5.00，10.00μg/L)asaddedtulturedellsafter24,48hfinubatin. The effetfXnapptsisfgranulsaellsasassessedbyTUNELethdandflytetry.RESULTS:Thereasspntaneusapptsisintheulturedgranulsaellsandtheapptsislikehangessuhasellshrinkage,ndensednulEi,rundedshape,drpingffallexistedinallntrlgrupsandexperientalgrupstreatedithX.IntheXgrups,theleastapptsislikegranulsaellserefundin1.25μg/Lgrup,andthenuberfapptsislikegranulsaellsinreasedgraduallyinther3testgrupsiththeinreasingnentratinsfX.Thenuberfapptsislikegranulsaellsassignifiantlyhigherin10.00μg/Lgrupthanthatinthergrups(P<0.05).AppttisignalseredetetedbyDNA3′endlabelingethdingranulsaellsfuse.Flytetryrevealedtheinreasingprprtinfearlystageappttiells(theaxiuas53.5%).NLUSIN:AhighernentratinfXayserveasaniprtantendrinedisruptingheial(ED),ediatingusegranulseellapptsisinvitrafterFBSasrevedfrediu.Theeffetisbidiretinalandnentratindependent.
【Keyrds】ethxyhlr;granulseell;apptsis;use
0引言
甲氧滴滴涕(ethxyhlr,X)是一种被人们主动投放于环境中的数量最大、毒性最广的化学物质，因其杀虫效果明显，被人们广泛应用于水果，蔬菜和园林中杀虫.近年来，X的生殖毒性作用不断被发现［1］,有研究表明长期接触X可导致生育能力下降［2-3］和异常胚胎细胞的形成［4］，但其生殖细胞的毒性作用机制仍不清楚，有关是否对卵泡颗粒细胞的生存具有影响的报道少见.本研究以小鼠离体培养的颗粒细胞为模型，观察具有雌激素样作用的环境污染物X对颗粒细胞存活的影响，以探讨X的雌性生殖细胞毒性作用机制.
1材料和方法
1．1材料健康，尚未性成熟的雌性昆明小鼠40只，体质量18～22g（第四军医大学实验动物中心）；甲氧滴滴涕（批号：49054，美国Siga公司）；DE/F12干粉细胞培养基，无脂肪酸牛血清白蛋白（BSA）（美国Gibl公司）；已二胺四乙酸（EDTA）、孕马血清(PSG）（天津生物制品公司）；无a2+,g2+磷酸盐缓冲液（PBS）（北京中杉金桥公司）；3′H末端原位细胞凋亡检测试剂盒、多聚赖氨酸、DAB显色试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)；流式细胞仪（美国EPIS公司）.
1．2方法
1．2．1小鼠颗粒细胞的制备及原代培养参照 文献 ［5］的方法制备颗粒细胞，选取小鼠，皮下注射PSG，10U/只，饲养温度22℃，12h光照，12h黑暗，允许自由饮水和摄食.48h后颈椎脱臼处死，无菌条件下迅速取出双侧卵巢，用PBS（-）清洗3次，在体视显微镜下除去卵巢周围包膜及脂肪组织.将卵巢置于DE/F12培养液中，37℃孵育15in.然后在解剖镜下用不锈钢针刺破排卵前卵泡使颗粒细胞和卵母细胞释放出来，加入1g/L透明质酸酶消化使颗粒细胞与卵母细胞分离，过200目筛网，1000r/in离心5in.弃去上清后，用DE/F12培养液（含0.5g/LBSA；5g/L蔗糖；6.8l/LEDTA），垂悬细胞沉淀.37℃50L/L2孵箱中孵育15in，然后用DE/F12培养液洗涤细胞3次，1000r/in离心5in.采用文献［6］的方法用台盼蓝排斥法检查活细胞比率（85%左右），细胞用一定量的无血清DE/F12培养基（含100U/L青霉素；100μg/L链霉素；0.5g/LBSA）稀释并用血细胞计数法计数，调整细胞密度，将细胞分别接种于两个250L无菌的培养瓶中.置于37℃50L/L2培养箱中预培养.
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